Thông tư 16/2014/TT-BNNPTNT Quy chuẩn Quốc gia về Kiểm dịch và Bảo vệ thực vật

Căn cứ Luật Tiêu chuẩn và Quy chuẩn kỹ thuật ngày 29 tháng 6 năm 2006;

Căn cứ Pháp lệnh Bảo vệ và Kiểm dịch thực vật số 36/2001/PL-UBTVQH10 ngày 25/7/2001;

Căn cứ Nghị định số 127/2007/NĐ-CP ngày 01 tháng 8 năm 2007 của Chính phủ quy định chi tiết thi hành một số điều của Luật Tiêu chuẩn và Quy chuẩn kỹ thuật;

Căn cứ Nghị định số 199/2013/NĐ-CP ngày 26 tháng 11 năm 2013 của Chính phủ quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn và cơ cấu tổ chức của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn;

Xét đề nghị của Cục trưởng Cục Bảo vệ thực vật;

Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về Kiểm dịch và Bảo vệ thực vật,

Ký hiệu: QCVN 01 - 159 : 2014/BNNPTNT

Ký hiệu: QCVN 01 - 160 : 2014/BNNPTNT

Ký hiệu: QCVN 01 - 161 : 2014/BNNPTNT

Ký hiệu: QCVN 01 - 162 : 2014/BNNPTNT

Ký hiệu: QCVN 01 - 163 : 2014/BNNPTNT

Ký hiệu: QCVN 01 - 164 : 2014/BNNPTNT

Ký hiệu: QCVN 01 - 165 : 2014/BNNPTNT

Ký hiệu: QCVN 01 - 166 : 2014/BNNPTNT

Ký hiệu: QCVN 01 - 167 : 2014/BNNPTNT

Ký hiệu: QCVN 01 - 168 : 2014/BNNPTNT

Ký hiệu: QCVN 01 - 169 : 2014/BNNPTNT

Ký hiệu: QCVN 01 - 170 : 2014/BNNPTNT

Ký hiệu: QCVN 01 - 171 : 2014/BNNPTNT

Ký hiệu: QCVN 01 - 172 : 2014/BNNPTNT

Ký hiệu: QCVN 01 - 173 : 2014/BNNPTNT

Ký hiệu: QCVN 01 - 174 : 2014/BNNPTNT

Ký hiệu: QCVN 01 - 175 : 2014/BNNPTNT

Ký hiệu: QCVN 01 - 176 : 2014/BNNPTNT

Ký hiệu: QCVN 01 - 177 : 2014/BNNPTNT

Ký hiệu: QCVN 01 - 178 : 2014/BNNPTNT

Ký hiệu: QCVN 01 - 179 : 2014/BNNPTNT

Ký hiệu: QCVN 01 - 180 : 2014/BNNPTNT

Ký hiệu: QCVN 01 - 181 : 2014/BNNPTNT

Trong quá trình thực hiện, nếu có vấn đề vướng mắc, đề nghị các cơ quan, tổ chức, cá nhân kịp thời phản ánh về Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn để Bộ nghiên cứu, sửa đổi, bổ sung./.

National technical regulation on Procedure for identification of Karnal bunt of wheat (Tilletia indica Mitra) - Plant quarantine pest of Vietnam

Lời nói đầu

QCVN 01 - 159 : 2014/BNNPTNT do Trung tâm Giám định Kiểm dịch thực vật biên soạn, Cục Bảo vệ thực vật trình duyệt Bộ Nông nghiệp & PTNT ban hành tại Thông tư số 16/TT-BNNPTNT ngày 05 tháng 6 năm 2014.

QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA VỀ QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH BỆNH PHẤN ĐEN LÚA MỲ TILLETIA INDICA MITRA LÀ DỊCH HẠI KIỂM DỊCH THỰC VẬT CỦA VIỆT NAM

National technical regulation on Procedure for identification of Karnal bunt of wheat (Tilletia indica Mitra) - Plant quarantine pest of Vietnam

1.1. Phạm vi điều chỉnh

Quy chuẩn này quy định quy trình giám định bệnh phấn đen lúa mỳ Tilletia indica Mitra - là dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm I của Việt Nam

1.2. Đối tượng áp dụng

Quy chuẩn này áp dụng đối với các tổ chức, cá nhân Việt Nam hoặc nước ngoài có hoạt động liên quan đến lĩnh vực bảo vệ và kiểm dịch thực vật thực hiện giám định bệnh phấn đen lúa mỳ Tilletia indica Mitra - là dịch hại kiểm dịch thực vật (KDTV) nhóm I thuộc Danh mục dịch hại KDTV của Việt Nam.

1.3. Giải thích từ ngữ

Trong quy chuẩn này, các từ ngữ dưới đây được hiểu như sau:

1.3.1. Dịch hại kiểm dịch thực vật (plant quarantine pest):

Là loài dịch hại có nguy cơ gây hại nghiêm trọng tài nguyên thực vật trong một vùng mà ở đó loài sinh vật này chưa xuất hiện hoặc xuất hiện có phân bố hẹp và phải được kiểm soát chính thức.

1.3.2. Thực vật (plant):

Là cây và những bộ phận của cây còn sống, kể cả hạt giống và sinh chất có khả năng làm giống.

1.3.3. Mẫu (sample):

Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật hoặc tàn dư của sản phẩm thực vật được lấy ra theo một qui tắc nhất định.

1.3.8. Tiêu bản (specimen):

Là mẫu vật điển hình tiêu biểu của dịch hại được xử lý để dùng cho việc định loại, nghiên cứu, giảng dạy, phổ biến kỹ thuật và trưng bày thành các bộ sưu tập.

1.3.9. Phản ứng chuỗi trùng hợp hoặc phản ứng khuếch đại gen (Polymerase Chain Reaction - PCR):

Là kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống.

2.1. Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu

2.1.1. Thu thập mẫu

Đối với hàng xuất, nhập khẩu, quá cảnh hoặc vận chuyển, bảo quản trong nước: Tiến hành lấy mẫu theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4731:89¹ "Kiểm dịch thực vật - phương pháp lấy mẫu", quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-23:2010/BNNPTNT¹ "Phương pháp kiểm tra các loại hạt xuất, nhập khẩu và quá cảnh".

Đối với cây trồng ngoài đồng ruộng; Lấy mẫu theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-38/2010/BNNPTNT¹ "Phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng".

2.1.2. Bảo quản mẫu

Các bộ phận tươi (bông) có triệu chứng bệnh chứa trong các túi ni-lông có lỗ thông khí bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 3 - 5^oC.

Mẫu hạt được chứa trong các túi ni-lông hoặc hộp nhựa kín và bảo quản ở nhiệt độ phòng.

Các tiêu bản lam của nấm được dán nhãn, để trong hộp chuyên dụng đựng tiêu bản lam và bảo quản ở nhiệt độ phòng.

2.2. Thiết bị dụng cụ, hóa chất

Kính lúp soi nổi có độ phóng đại 10 - 40 lần, kính hiển vi có độ phóng đại 40 - 1.000 lần.

Lưới lọc (kích thước mắt lưới 53m, 20m), bình tam giác, máy ly tâm, máy lắc, tủ sấy, tủ định ôn, cân điện, bể ổn nhiệt, máy PCR, máy điện di, hệ thống chụp ảnh...

Bộ dao, kim giải phẫu, panh, kéo, bộ micro pipet.

Đèn cồn, đĩa petri, ống hút, lam, lamen, cốc đong, giấy parafilm.

Cồn 70^o, lactophenol, acid lactic, nước cất vô trùng, Tween 20, Na₂HPO₄, KH₂PO₄, Glycerol, ethylium bromide, agarose, cycloheximide.

Kít chiết tách DNA, kit PCR

2.3. Phương pháp phát hiện và giám định bệnh

2.3.1. Phát hiện và thu thập mẫu bệnh

Cây nhiễm bệnh thấp hơn, bông ngắn, số lượng hạt trên bông giảm (hình 1, phụ lục 1). Nấm chỉ gây bệnh trên một số hạt trên bông, các hạt nhiễm bệnh thường bị lép.

Ban đầu có chấm đen nhỏ dưới phần nội nhũ và rãnh hạt.

Khi xâm nhiễm trên hạt, nấm làm cho hạt có mùi tanh (do trimethylamine) tương tự như nấm T. tritici, T. foetida và T. controversa. Hạt bị xâm nhiễm từ phần rốn hạt và chạy dọc theo đường rãnh hạt (không gây nhiễm nội nhũ), hạt có thể bị vỡ hoàn toàn hoặc bị nứt một phần (hình 2, phụ lục 1). Khi bệnh nặng, mô dọc theo rãnh hạt và vùng tiếp giáp nội nhũ bị thay thế bởi các bào tử. Mày hạt bị tách ra làm cho hạt bị nhiễm bệnh lộ ra ngoài, cả hạt và phần mày hạt có thể bị rụng khỏi bông.

2.3.2. Phương pháp giám định bằng đặc điểm hình thái nấm gây bệnh

2.3.2.1. Phương pháp kiểm tra trực tiếp

Dùng kim khêu nấm khêu lớp bào tử trên hạt đặt lên lam kính đã có sẵn một giọt axit lactic và đậy lamen.

Đặt lam lên kính hiển vi và quan sát đặc điểm hình thái và đo kích thước của bào tử nấm.

Đối chiếu với hình dạng và kích thước bào tử phấn đen lúa mỳ Tilletia indica Mitra (phụ lục 1).

2.3.2.2. Phương pháp rửa quay ly tâm

Lấy 50g hạt lúa mỳ cho vào bình tam giác 250ml. Thêm vào bình 100ml dung dịch Tween-20 nồng độ 0,01%, đậy nắp bình (có thể bao kín bằng giấy parafilm). Đặt bình tam giác lên máy lắc hoặc lắc bằng tay trong vòng 3 phút để các bào tử rời ra khỏi hạt lúa mỳ. Chuẩn bị một bình lọc bao gồm một bình tam giác, một phễu trong đó có 1 lưới lọc kích thước 53m. Đỗ dịch và hạt lúa mỳ lên phễu của bình tam giác đã chuẩn bị. Dùng bình phun nước cất rửa hạt lúa mì còn ở trên lưới 3 lần (mỗi lần dùng 20-50ml nước cất). Tiếp tục rửa hạt lúa mì bằng nước cất đến khi lượng nước trong bình đạt từ 300-400ml. Bỏ lưới lọc, rửa phễu lọc 2 lần bằng nước cất mỗi lần 10-20ml nước.

Chuẩn bị bộ lọc thứ 2 bao gồm 1 bình tam giác; 1 phễu trong đó có đặt một lưới lọc 20m (lưới lọc này có thể ngâm trong nước trước để có hiệu quả lọc tốt hơn). Rót dịch thu được ở trên qua bộ lọc đã chuẩn bị. Rửa bình chứa dịch 2 lần bằng 10ml nước cất. Nghiêng lưới lọc một góc 30-35^o rửa nhẹ nhàng lưới lọc bằng nước cất sao cho phần cặn còn lại trên lưới lọc dồn sang bên cạnh của lưới lọc. Dùng công tơ hút hút dịch và cặn trên lưới lọc vào ống ly tâm. Ly tâm dịch thu được ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 3 phút. Phần cặn thu được sau ly tâm hòa tan lại trong nước cất để đạt dung tích khoảng 50-100l.

Hút dịch lên lam kính, đậy lamen quan sát và đo đếm đặc điểm hình thái của bào tử nấm gây bệnh trên kính hiển vi và so sánh với đặc điểm bào tử của nấm Tilletia indica (phụ lục 1)

Lưu ý: Trong trường hợp mẫu hạt đã qua xử lý hóa chất diệt nấm, hạt phải được ngâm trong NaOH (0,2% hoặc 1%) trong 24 giờ trước khi rửa, quay ly tâm

2.3.2. Phương pháp giám định PCR

Sử dụng phương pháp PCR để giám định đối với nấm gây bệnh phấn đen lúa mỳ Tilletia indica Mitra.

Quy trình chi tiết như phụ lục 2.

Sau khi khẳng định kết quả giám định bệnh phấn đen lúa mỳ Tilletia indica Mitra - là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam, đơn vị giám định phải gửi báo cáo về Cục Bảo vệ thực vật kèm theo phiếu kết quả giám định (phụ lục 3).

Tất cả các đơn vị thuộc hệ thống Bảo vệ và KDTV phải lưu giữ, quản lý và khai thác dữ liệu về kết quả điều tra, báo cáo và giám định bệnh phấn đen lúa mỳ Tilletia indica Mitra.

Đối với đơn vị lần đầu tiên giám định và phát hiện được bệnh phấn đen lúa mỳ Tilletia indica Mitra phải gửi mẫu hoặc tiêu bản về Trung tâm Giám định kiểm dịch thực vật để thẩm định.

Đơn vị giám định phải đảm bảo thời gian lưu mẫu theo quy định hiện hành.

Cục Bảo vệ thực vật có trách nhiệm phổ biến; tổ chức, hướng dẫn và kiểm tra việc thực hiện Quy chuẩn này trong hệ thống tổ chức chuyên ngành Bảo vệ và Kiểm dịch thực vật cũng như các tổ chức, cá nhân khác có liên quan;

Các tổ chức, cá nhân có hoạt động liên quan đến điều tra, thu thập mẫu, xử lý và bảo quản mẫu bệnh phấn đen lúa mỳ tại Việt Nam phải tuân theo quy định của quy chuẩn này cũng như các quy định của pháp luật có liên quan hiện hành.

Bộ dao, kim giải phẫu, panh, kéo, bộ micro pipet, túi ni-lông, bản ELISA

Đèn cồn, đĩa petri, ống hút, lam, lamen, cốc đong, giấy parafilm.

Na₂CO₃, NaHCO₃, NaN₃, NaCI, KCl, MgCI₂.6H₂O, HN(CH₂CH₂OH)₂, MgSO₄.7H₂O, KH₂PO₄, K₂HPO₄, Na₂HPO₄, NaOH,

Cồn tuyệt đối, cồn 70% nước cất vô trùng, Tween 20, glycerol, ethylium bromide, agarose, cycloheximide. môi trường NGA (Nutrient Glucose Agar) hoặc YPGA (Yeast Peptone Glucose Agar). Kít PCR, kháng thể

2.3. Phương pháp phát hiện và giám định bệnh

2.3.1. Phát hiện và thu thập mẫu bệnh

Trên lá, vết bệnh ban đầu là những đốm màu xanh nhợt có dạng giọt dầu ở phần phiến lá giữa các gân lá. Các vết này nhanh chóng khô đi tạo ra các vết chết hoại có màu trắng hoặc màu nâu (hình 1, phụ lục 1). Khi bệnh từ phiến lá xâm nhiễm vào hệ thống mạch dẫn một số lá chét ở một phía của lá kép bị héo rũ (hình 2, phụ lục 1).

Trên thân cây, triệu chứng bệnh có thể là các sọc vàng, đôi khi thân bị nứt dọc theo các đốt thân (hình 3, phụ lục 1). Bó mạch của các cây nhiễm bệnh có màu vàng sậm hoặc nâu (hình 4, phụ lục 1).

Trên quả, triệu chứng thường bắt đầu từ những đốm nhỏ hơi lồi lên, vết bệnh có viền hoặc quầng trắng. Các vết bệnh phát triển to ra và có màu nâu ở tâm vết bệnh tạo ra dạng "mắt chim" (hình 5, phụ lục 1).

Trên hạt, bệnh không biểu hiện triệu chứng.

2.3.2. Phân lập vi khuẩn

2.3.2.1. Tách chiết vi khuẩn

Tách chiết vi khuẩn từ mô cây (lá, thân, quả): Cắt một đoạn mô cây đã được khử trùng bề mặt bằng cồn 70^o ngâm trong nước cất vô trùng 30 phút hoặc nghiền nhỏ mô cây trong nước cất vô trùng.

Tách chiết vi khuẩn từ hạt: Lượng mẫu tối thiểu để tách chiết là 2.000 hạt (khoảng 7g). Hạt được cho vào bình tam giác có chứa 20ml dịch chiết hạt (phụ lục 2) và lắc mạnh bằng tay trong 20-30 giây. Sau đó, đưa bình tam giác có dịch chiết hạt lên máy lắc và lắc trong 36-48 giờ với tốc độ 150 vòng/phút.

2.3.2.2. Phân lập vi khuẩn trên môi trường nhân tạo

Trải đều 1ml dịch chiết thu được từ mô cây hoặc từ hạt trên môi trường bán đặc hiệu và nuôi cấy ở 26^oC trong 8 ngày.Theo dõi sự xuất hiện của khuẩn lạc. Khuẩn lạc của vi khuẩn C. michiganensis subsp. michiganensis có màu vàng sáng, phồng, có dạng tròn đôi khi có dạng bất định.

Các khuẩn lạc điển hình được cấy truyền trên môi trường NGA (Nutrient Glucose Agar) hoặc YPGA (Yeast Peptone Glucose Agar)

2.3.3. Giám định bằng phương pháp ELISA (chỉ áp dụng đối với mẫu quả, cây, vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường nhân tạo)

2.3.3.1. Chuẩn bị dịch mẫu

Mẫu mô cây (quả, thân, lá): lấy một mẫu nhỏ mô cây (quả hoặc thân hoặc lá) ngâm trong 1ml nước cất khoảng 15-20 phút. Sau đó nước chứa vi khuẩn được ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút thu tủa vi khuẩn. Hòa tan tủa vi khuẩn thu được trong 1ml dung dịch đệm chiết mẫu (phụ lục 2).

Đối với vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường nhân tạo: Hòa tan một phần khuẩn lạc trong 1ml dung dịch đệm chiết mẫu.

Nhỏ vào mỗi giếng ELISA 100l dịch mẫu đã chuẩn bị. Bọc bản giếng bằng túi ni-lông ủ ở 37^oC qua đêm (khoảng 4-6 giờ). Sau đó, nhỏ thêm vào mỗi giếng 200l dung dịch đệm cố định mẫu (phụ lục 2). Bọc bản giếng bằng túi ni-lông ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng. Rửa giếng bằng đệm rửa (phụ lục 2) ba lần sau đó loại sạch đệm rửa bằng cách vỗ nhẹ bản giếng trên giấy thấm. Thêm vào mỗi giếng 100l kháng thể. Bọc bản giếng bằng túi ni-lông ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Rửa giếng bằng đệm rửa tám lần sau đó loại sạch đệm rửa bằng cách vỗ nhẹ bản giếng trên giấy thấm. Thêm vào mỗi giếng 100l Enzym gắn. Bọc bản giếng bằng túi ni-lông ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng.

Rửa giếng bằng đệm rửa tám lần sau đó loại sạch đệm rửa bằng cách vỗ nhẹ bản giếng trên giấy thấm. Thêm vào mỗi giếng 100l đệm cơ chất (phụ lục 2). Ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng.

Đọc kết quả bằng mắt thường hoặc bằng máy đọc ở bước sóng 405nm.

2.3.4. Giám định bằng phương pháp PCR

2.3.4.1. Tách chiết DNA

Tách chiết DNA từ vi khuẩn đã phân lập (xem mục 2.3.2.2): Dùng que cấy vi khuẩn lấy một khuẩn lạc trên môi trường cho vào ống eppendorf đã chứa 100l nước cất vô trùng khuấy đều để hòa tan khuẩn lạc. Tiếp theo để ống eppendorf ở nhiệt độ 95^oC trong 15 phút trong bể ổn nhiệt sau đó đặt ngay lên đá lạnh. Ly tâm dịch vi khuẩn trong 5-10 giây.

Tách chiết DNA từ dịch vi khuẩn (xem mục 2.3.2.1): Cho 100l dịch chiết vi khuẩn vào ống eppendorf và để ở nhiệt độ 95^oC trong 15 phút trong bể ổn nhiệt sau đó đặt ngay lên đá lạnh. Tiếp theo, ly tâm dịch chiết trong 5-10 giây.

2.3.4.2. Quy trình giám định bằng PCR

Đoạn mồi sử dụng

Chu trình nhiệt:

Đọc kết quả sản phẩm được điện di bằng gel agarose 2% trong đệm TAE, nhuộm bản gel trong dung dịch ethydium bromide và quan sát dưới đèn UV.

Mẫu dương tính cho đoạn gen kích thước 270bp.

Sau khi khẳng định kết quả giám định bệnh thối loét cà chua Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al. là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam, đơn vị giám định phải gửi báo cáo về Cục Bảo vệ thực vật kèm theo phiếu kết quả giám định (phụ lục 3).

Đối với đơn vị lần đầu tiên giám định và phát hiện được bệnh thối loét cà chua (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al.) phải gửi mẫu hoặc tiêu bản về Trung tâm Giám định kiểm dịch thực vật để thẩm định.

Tất cả các đơn vị thuộc hệ thống Bảo vệ và KDTV phải lưu giữ, quản lý và khai thác dữ liệu về kết quả điều tra, báo cáo và giám định bệnh thối loét cà chua là dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm I của Việt Nam.

Đơn vị giám định phải đảm bảo thời gian lưu mẫu theo quy định hiện hành.

Cục Bảo vệ thực vật có trách nhiệm phổ biến; tổ chức, hướng dẫn và kiểm tra việc thực hiện Quy chuẩn này trong hệ thống tổ chức chuyên ngành Bảo vệ và Kiểm dịch thực vật cũng như các tổ chức, cá nhân khác có liên quan;

Các tổ chức, cá nhân có hoạt động liên quan đến điều tra, thu thập mẫu, xử lý và bảo quản mẫu bệnh thối loét cà chua tại Việt Nam phải tuân theo quy định của quy chuẩn này cũng như các quy định của pháp luật có liên quan hiện hành.

Bộ dao, kim giải phẫu, panh, kéo, bộ piptet, găng tay, đèn cồn, đĩa petri, ống hút, lam, lamen, bình tam giác, cốc đong, ống ly tâm 1,5ml.

Cồn 70^o, cồn tuyệt đối, parafin, lactophenol blue, acid acetic, nước cất vô trùng.

Nitơ lỏng, NaCI, phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1), chloroform, isopropanol, Proteinase K, Tris-HCI, EDTA, SDS.

MgCI₂ ,KCI, dNTP, mồi, Taq DNA polymerase, agarose.

2.3. Phương pháp phát hiện và giám định bệnh

2.3.1. Phát hiện và thu thập mẫu bệnh

Khi lá bị nhiễm bệnh gân lá trở nên trong (gân chính hoặc gân phụ), lá cong và biến vàng, chồi non cũng bị biến vàng. Sau đó lá rụng còn lại cuống lá, cành bị héo và bị chết ngọn (hình 1 đến hình 4, phụ lục 1). Đôi khi trên lá rụng các gân chính hoặc gân phụ có thể biến thành màu đỏ.

Cành bị bệnh có màu nâu hoặc màu nâu nhạt và bị nứt ra bệnh nặng đoạn thân và cành khô, có màu xám tro, trên mặt vết bệnh có các hạt nhỏ màu đen (hình 5, phụ lục 1)

Trên thân cây nhiễm bệnh, khi cắt ngang các mô cây hóa màu hồng hoặc nâu với các mô già (hình 6, phụ lục 1).

2.3.2. Phương pháp giám định bằng đặc điểm hình thái nấm gây bệnh

2.3.2.1. Phương pháp kiểm tra trực tiếp

Bào tử và các quả cành của nấm P. tracheiphila có thể quan sát trực tiếp dưới kính hiển vi quang học. Để quan sát rõ cấu trúc của bào tử và quả cành có thể nhuộm bằng lactophenol blue.

Dùng kim khêu nấm khêu bào tử nấm và quả cành trực tiếp từ các bộ phận bị phần nghi ngờ nhiễm bệnh hoặc có triệu chứng điển hình, đặt lên lam đã có 01 giọt lactophenol và đậy lamen. Đặt lam lên kính hiển vi và quan sát đặc điểm hình thái, đo kích thước bào tử nấm và so sánh với đặc điểm bào tử của nấm P. tracheiphila (phụ lục 1).

2.3.2.2. Phương pháp để ẩm

Các cành khô, các mẫu thân có triệu chứng bệnh (trên cành có các vùng khô màu xám chì hoặc xám tro, các thân cây mà mạch dẫn hóa màu hồng) để ẩm trong 12-24 giờ. Sau đó dùng kim khêu nấm khêu bào tử trực tiếp từ các phần nghi ngờ nhiễm bệnh, đặt lên lam đã có 01 giọt lactophenol. Đặt lam lên kính hiển vi và tìm, quan sát đặc điểm hình thái, đo kích thước bào tử nấm.

Quan sát trên kính hiển vi so sánh với đặc điểm bào tử của nấm P. tracheiphila (phụ lục 1)

2.3.2.3. Phương pháp phân lập nấm từ vật liệu nhiễm bệnh

Cắt ở phần rìa vết bệnh một đoạn thân, cành khoảng 20-100mm và nhúng vào cồn tuyệt đối. Sau đó, đốt đoạn thân trên đèn cồn. Khi lửa tắt dùng dao khử trùng cắt ngang hoặc dọc đoạn thân, cành thành những lát mỏng.

Nuôi cấy các lát mỏng trên môi trường PDA hoặc CPA ở 22-24^oC. Sau 3-5 ngày, kiểm tra sắc tố nấm tiết ra trên đĩa môi trường bằng cách soi đĩa lên ánh sáng (hình 9, phụ lục 1). Tiếp theo, cấy truyền làm thuần nấm.

Khêu mẫu nấm đã thuần từ môi trường nuôi cấy đưa lên lam và quan sát dưới kính hiển vi. Quan sát đặc điểm hình thái của bào tử nấm thu được.

So sánh với đặc điểm hình thái của bào tử nấm P. tracheiphila (phụ lục 1)

2.3.3. Phương pháp giám định PCR

Sử dụng phương pháp PCR để giám định nấm P. tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili gây bệnh khô cành cam quýt.

Quy trình chi tiết như phụ lục 2.

Sau khi khẳng định kết quả giám định bệnh khô cành cam quýt Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili- là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam, đơn vị giám định phải gửi báo cáo về Cục Bảo vệ thực vật kèm theo phiếu kết quả giám định (phụ lục 4).

Tất cả các đơn vị thuộc hệ thống Bảo vệ và KDTV phải lưu giữ, quản lý và khai thác dữ liệu về kết quả điều tra, báo cáo và giám định bệnh khô cành cam quýt.

Đối với đơn vị lần đầu tiên giám định và phát hiện được bệnh khô cành cam quýt Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili phải gửi mẫu hoặc tiêu bản về Trung tâm Giám định kiểm dịch thực vật để thẩm định.

Đơn vị giám định phải đảm bảo thời gian lưu mẫu theo quy định hiện hành.

Cục Bảo vệ thực vật có trách nhiệm phổ biến; tổ chức, hướng dẫn và kiểm tra việc thực hiện Quy chuẩn này trong hệ thống tổ chức chuyên ngành Bảo vệ và Kiểm dịch thực vật cũng như các tổ chức, cá nhân khác có liên quan;

Các tổ chức, cá nhân có hoạt động liên quan đến điều tra, thu thập mẫu, xử lý và bảo quản mẫu bệnh khô cành cam quýt Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili tại Việt Nam phải tuân theo quy định của quy chuẩn này cũng như các quy định của pháp luật có liên quan hiện hành.

Bộ dao, kim giải phẫu, panh, kéo, đèn cồn, đĩa petri, lam, lamen

Cồn 70%, lactophenol

2.3. Phương pháp phát hiện và giám định bệnh

2.3.1. Phương pháp phát hiện và thu thập mẫu bệnh

Trên lá non (giai đoạn lá đỏ đồng): lá đổi màu và biến dạng, Các vết bệnh không có hình dạng nhất định và phát triển ở mặt dưới của lá (hình 1, phụ lục 1). Bệnh nặng lá có thể co lại và rụng. Cuống lá vẫn đính trên cây vài ngày sau mới rụng.

Trên lá non: bề mặt vết bệnh điển hình phủ lớp mốc màu xám đen. (hình 2, phụ lục 1). Lá bị bệnh nhỏ và biến dạng so với lá khỏe. Mặt trên của lá ở những điểm tương ứng với vết bệnh sẽ biến vàng.

Trên lá trưởng thành: vết bệnh tạo thành các u lồi hình nhẫn ở mặt trên của lá.

Trên lá già: mô ở phần trung tâm vết bệnh chết hoại có màu trắng như giấy và sau đó rời ra để lại các lỗ thủng trên lá (hình 3, phụ lục 1).

Nấm còn gây hại các bộ phận khác của cây như gân chính, cuống lá, chùm hoa, quả và thân. Thân bị nhiễm bệnh, cây có thể bị chết ngọn.

2.3.2. Phương pháp giám định bệnh

Dùng kim khêu nấm khêu bào tử nấm trực tiếp từ các lớp mốc trên các phần nghi ngờ nhiễm bệnh, đặt lên lam đã có 01 giọt lactophenol. Đặt lam lên kính hiển vi tìm và quan sát đặc điểm hình thái, đo kích thước bào tử nấm.

So sánh với đặc điểm và kích thước của bào tử nấm Microcyclus ulei (Henn.) Arx (phụ lục 1)

Sau khi khẳng định kết quả giám định bệnh rụng lá cao su Nam Mỹ Microcyclus ulei (Henn.) Arx) là dịch hại Kiểm dịch thực vật của Việt Nam, đơn vị giám định phải gửi báo cáo về Cục Bảo vệ thực vật kèm theo phiếu kết quả giám định (phụ lục 2).

Tất cả các đơn vị thuộc hệ thống Bảo vệ và KDTV phải lưu giữ, quản lý và khai thác dữ liệu về kết quả điều tra, báo cáo và giám định bệnh rụng lá cao su Nam Mỹ Microcyclus ulei (Henn.) Arx).

Đối với đơn vị lần đầu tiên giám định và phát hiện được bệnh rụng lá cao su Nam Mỹ Microcyclus ulei (Henn.) Arx phải gửi mẫu hoặc tiêu bản về Trung tâm Giám định kiểm dịch thực vật để thẩm định.

Đơn vị giám định phải đảm bảo thời gian lưu mẫu theo quy định hiện hành.

Cục Bảo vệ thực vật có trách nhiệm phổ biến; tổ chức, hướng dẫn và kiểm tra việc thực hiện Quy chuẩn này trong hệ thống tổ chức chuyên ngành Bảo vệ và Kiểm dịch thực vật cũng như các tổ chức, cá nhân khác có liên quan;

Các tổ chức, cá nhân có hoạt động liên quan đến điều tra, thu thập mẫu, xử lý và bảo quản mẫu bệnh rụng lá cao su Nam Mỹ tại Việt Nam phải tuân theo quy định của quy chuẩn này cũng như các quy định của pháp luật có liên quan hiện hành.

Phụ lục 1.

Thông tin về dịch hại

1.1. Phân bố

Trong nước: Bệnh chưa có ở Việt Nam

Trên thế giới: Chỉ phân bố ở châu Mỹ: Brazil, Belize, Costa Rica, El Salvador, Guatemala, Haiti, Honduras, Nicaragua, Panama, Trinidad và Tobago, Bolivia, Colombia, Ecuador, French Guiana, Guyana, Peru, Suriname, Venezuela, Dominica, Mexico

1.2. Ký chủ

Kí chủ chính là cao su (Hevea brasiliensis) ngoài ra còn kí sinh trên H. benthamiana, H. camargoana, H. camporum, H. guianensis, H. pauciflora và H. spruceana, và loài lai giữa các loài trên.

Tên tiếng Việt: Bệnh rụng lá cao su Nam Mỹ

Tên khoa học: Microcyclus ulei (Henn.) Arx

Tên khác:

Passalora heveae Massee, nom. nud. [anamorph]

Aposphaeria ulei Henn. [anamorph]

Dothidella ulei Henn. [teleomorph]

Fusicladium heveae K. Schub. & U. Braun [anamorph]

Fusiciadium macrosporum J. Küyper [anamorph]

Melanopsammopsis ulei (Henn.) Stahel [teleomorph]

Vị trí phân loại:

Lớp: Dothideomycetes

Bộ: Capnodiales

Họ: Mycosphaerellaceae

Hình 1: Giai đoạn đầu của bệnh SALB trên lá non

(Nguồn: FAO, 2012)

Giám định nấm chủ yếu dựa trên đặc điểm hình thái của bào tử nấm. Nấm M. ulei thuộc lớp nấm túi (Ascomycete), nấm sản sinh 3 loại bào tử: Bào tử phân sinh; bào tử phấn và bào tử túi.

Bào tử phân sinh có vách ngăn (2 tế bào) hoặc có một số ít là đơn bào. Bào tử có hình gậy, tế bào phía trên to hơn tế bào phía dưới, phần đuôi cụt và bào tử có dạng xoắn đặc trưng (hình 4). Bào tử có màu trong suốt khi còn non sau đó xám dần theo thời gian. Kích thước của bào tử khá đa dạng 23-65x5-10m (Chee); 23-62x5-10m (Holliday); 12-30x5-8m (Langford). Trong điều kiện khô thì bào tử teo lại (hình 5) và sẽ căng lên khi gặp ẩm độ cao.

Bào tử phấn có dạng chày một đầu to hơn (12-25m) đầu kia (2-5m). Bào tử dài 6-10m. Bào tử túi 2 tế bào có vách ngăn thắt lại. Tế bào có kích thước không đồng đều 3-5 x 10-15 m (Langford, 1945); 2-5 x 12-20 m (Holliday, 1970); 12-20 x 2-5 m (Chee and Holliday, 1986).

Bộ phụ: Aphelenchina

Họ: Aphelenchoididae

2.1. Đặc điểm chung

- Tuyến trùng hình giun dài, rất mảnh, vùng môi nhẵn, phẳng và cao. Nút chân kim hút rất mờ, có bốn đường bên. Diều hình bầu dục, hơi vuông, tuyến thực quản rất mảnh.

- Con cái có hai buồng trứng, lỗ sinh dục nằm ở nửa cuối thân. Nhìn từ mặt bụng, lỗ sinh dục có dạng khe, nhìn như hình chữ C. Túi sau dạ con thon dài. Đuôi thon dài, gần thành dạng hình trụ. Mút đuôi tròn.

- Con đực: đuôi cong nhọn, gần có dạng trụ ở phía trước, dạng nón ở phía sau, mút đuôi nhọn. Vây bao quanh đuôi

2.2. Đặc điểm nhận dạng tuyến trùng Rhadinaphelenchus cocophilus (Cobb) Goodey là dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm I của Việt Nam

- Trứng: Hình bầu dục, dài.

- Ấu trùng: Hình giun, đầu cao, dạng vòm, không phân chia với phần thân. Đuôi ấu trùng tuổi 2 và 3 hình nón, mút đuôi dạng mấu nhọn sắc. Ấu trùng tuổi 4 có đuôi khác nhau giữa cá thể đực và cái (dạng lưỡng hình): ở ấu trùng cái, mút đuôi tròn, trong khi ở ấu trùng đực mút đuôi nhọn sắc.

- Con cái: L= 0,97 - 1,18 mm, a=78-96; b=8,7, c=9,5 - 13,2, V=64 - 68%, kim hút=10-13m .

- Con đực: L=0,84-1,16 mm, a=100-179, b= 6,5, c=24-35, T=50-68%, kim hút= 15,3 (10,7-13,8) m.

Hình 1. Tuyến trùng Rhadinaphelenchus cocophilus (Cobb) Goodey

A,F: Tuyến trùng trưởng thành; B-D,G: đầu con cái; E: đầu con đực;

H,N,O: đuôi con đực; I: trứng; J: đuôi con cái; K: mút đuôi con cái;

L: diều giữa con cái; M: gai giao vĩ; P: vây đuôi nhìn từ mặt lưng;

Q,R: mút đuôi ấu trùng; S: đầu ấu trùng; T: Lỗ sinh dục nhìn từ mặt bên;

U: Lỗ sinh dục nhìn từ mặt bụng

(Nguồn: Brathwaite C.W.D. và Siddiqi M.R., 1975)

Trong đó:

L: Tổng chiều dài cơ thể

a: Chiều dài cơ thể/chiều rộng lớn nhất (thường là vị trí vulva)

b: Chiều dài cơ thể/chiều dài từ đỉnh đầu cơ thể đến van ruột-thực quản

c: Chiều dài cơ thể/chiều dài đuôi

V: Chiều dài cơ thể từ đỉnh đến vulva x 100/chiều dài cơ thể

T: Chiều dài từ lỗ huyệt đến đỉnh của tinh hoàn x 100/chiều dài cơ thể

Bộ phụ: Aphelenchina

Họ: Aphelenchoididae

Giống: Rhadinaphelenchus

Loài: R. cocophilus

Là dịch hại kiểm dịch thực vật thuộc danh mục dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam.

QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA VỀ QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH BỆNH UNG THƯ KHOAI TÂY SYNCHYTRIUM ENDOBIOTICUM (SCHILB) PERCIVAL LÀ DỊCH HẠI KIỂM DỊCH THỰC VẬT CỦA VIỆT NAM

National technical regulation on Procedure for identification of Potato wart disease (Synchytrium endobioticum (Schilb) Percival)-Plant quarantine pest of Vietnam

Lời nói đầu

QCVN 01 - 181 : 2014/BNNPTNT do Trung tâm Giám định Kiểm dịch thực vật biên soạn, Cục Bảo vệ thực vật trình duyệt, Bộ Nông nghiệp & PTNT ban hành tại Thông tư số 16/TT-BNNPTNT ngày 05 tháng 6 năm 2014.

QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA VỀ QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH BỆNH UNG THƯ KHOAI TÂY SYNCHYTRIUM ENDOBIOTICUM (SCHILB) PERCIVAL LÀ DỊCH HẠI KIỂM DỊCH THỰC VẬT CỦA VIỆT NAM

National technical regulation on Procedure for identification of Potato wart disease (Synchytrium endobioticum (Schilb) Percival)-Plant quarantine pest of Vietnam

1.1. Phạm vi điều chỉnh

Quy chuẩn này quy định quy trình giám định bệnh ung thư khoai tây (Synchytrium endobioticum (Schilb) Percival) là dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm I của Việt Nam

1.2. Đối tượng áp dụng

Quy chuẩn này áp dụng đối với các tổ chức, cá nhân Việt Nam hoặc nước ngoài có hoạt động liên quan đến lĩnh vực bảo vệ và kiểm dịch thực vật thực hiện giám định bệnh ung thư khoai tây (Synchytrium endobioticum (Schilb) Percival- là dịch hại kiểm dịch thực vật (KDTV) nhóm I thuộc Danh mục dịch hại KDTV của Việt Nam ban hành kèm theo Quyết định số 73/2005/QĐ-BNN ngày 14/11/2005 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và PTNT.

1.3. Giải thích từ ngữ

Trong quy chuẩn này, các từ ngữ dưới đây được hiểu như sau:

1.3.1. Dịch hại kiểm dịch thực vật (plant quarantine pest)

Là loài dịch hại có nguy cơ gây hại nghiêm trọng tài nguyên thực vật trong một vùng mà ở đó loài sinh vật này chưa xuất hiện hoặc xuất hiện có phân bố hẹp và phải được kiểm soát chính thức.

1.3.2. Thực vật (plant)

Là cây và những bộ phận của cây còn sống, kể cả hạt giống và sinh chất có khả năng làm giống.

1.3.3. Mẫu (sample)

Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật hoặc tàn dư của sản phẩm thực vật được lấy ra theo một qui tắc nhất định.

1.3.8. Tiêu bản (specimen)

Là mẫu vật điển hình tiêu biểu của dịch hại được xử lý để dùng cho việc định loại, nghiên cứu, giảng dạy, phổ biến kỹ thuật và trưng bày thành các bộ sưu tập.

2.1. Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu

2.1.1. Thu thập mẫu

Đối với hàng xuất, nhập khẩu, quá cảnh hoặc vận chuyển, bảo quản trong nước: Tiến hành lấy mẫu theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4731:89¹ "Kiểm dịch thực vật - phương pháp lấy mẫu", quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-21:2010/BNNPTNT¹ "Phương pháp kiểm tra củ, quả xuất nhập khẩu và quá cảnh".

Đối với cây trồng ngoài đồng ruộng: Lấy mẫu theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-38/2010/BNNPTNT¹ "Phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng". Riêng đối với mẫu đất, phải lấy ở độ sâu tối thiểu 50cm.

2.1.2. Bảo quản mẫu

Các bộ phận tươi nghi có triệu chứng bệnh (lá, thân, rễ, củ...) được để trong các túi ni-lông có lỗ thông khí có đính nhãn và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 3 - 5^oC,

Mẫu đất được cho vào túi ni-lông, có lỗ thông khí, có đính nhãn và để ở những nơi thoáng mát hoặc ở nhiệt độ phòng.

Các tiêu bản lam của nấm được dán nhãn, để trong hộp chuyên dụng đựng tiêu bản lam và bảo quản ở nhiệt độ phòng.

2.1.3. Thiết bị dụng cụ, hóa chất

Kính lúp soi nổi có độ phóng đại 10 - 40 lần (10-40x), kính hiển vi có độ phóng đại 40 - 1000 lần

Máy ly tâm, máy lắc, tủ sấy, tủ định ôn, cân điện.

Bộ dao, kim giải phẫu, panh, kéo, dao lam, bộ rây lọc đất

Đèn cồn, đĩa petri, ống hút, lam, lamen, bình tam giác, cốc đong, giấy lọc

Axit lactic 98%, chloroform, CaCI₂, lactoglycerol.

2.3. Phương pháp phát hiện và giám định bệnh

2.3.1. Phát hiện và thu thập mẫu bệnh

Trên phần gốc thân: U có màu trắng hoặc xanh lá (nếu lộ sáng) tới màu nâu, khi thành thục các u này chuyển thành màu đen và sau đó bị thối, (hình 1, phụ lục 1)

Trên lá: cuống lá phình to tạo dạng "cánh", (hình 2, phụ lục 1)

Trên củ: Các u sưng lúc đầu có màu trắng tới nâu và sẽ chuyển sang màu đen khi bị thối và sẽ rời ra khỏi củ (hình 3, 4, phụ lục 1) Các u sưng có nhiều hình dạng khác nhau, có thể là hình cầu hay dạng hoa súp lơ, kích thước các u sưng có thể từ 1-8cm nhưng đôi khi có thể to bằng nắm tay. Bệnh gây hại trên mắt củ nhưng nếu bị nặng toàn bộ củ có thể trở thành các khối u sưng. Nếu bệnh nhiễm sớm trong giai đoạn củ mới phát triển củ sẽ bị biến dạng và trở nên xốp hơn. Vào cuối giai đoạn sinh trưởng của củ, các u sưng có thể bị khô hoặc thối hay rời ra khỏi củ vì vậy đôi khi triệu chứng trên củ mới thu hoạch rất khó nhận biết. Trong quá trình bảo quản trong kho các vết bệnh lại phát triển thành u sưng và u sưng có màu tương tự như vỏ củ khoai tây.

Trên rễ củ: Triệu chứng tương tự như trên củ.

Trên rễ tơ: Nấm không gây hại trên rễ tơ của khoai tây nhưng có gây hại trên rễ tơ của một số kí chủ phụ khác như cà chua.

2.3.2. Phương pháp giám định

2.3.2.1. Đối với củ, thân, lá và rễ

Dùng dao lam cắt lát các phần nghi ngờ, độ dày của lát cắt nên nhỏ hơn 1 mm và có độ dài 3mm. Đặt lát cắt thu được lên lam kính, nhỏ một giọt axit lactic lên lát cắt và đậy lamen. Quan sát và đo đếm đặc điểm hình thái của bào tử dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 40 lần.

So sánh với đặc điểm hình thái của bào tử đông của nấm Synchytrium endobioticum (hình 5, 6 phụ lục 1)

Chú ý: Nếu lát cắt quá dày sẽ rất khó quan sát cấu trúc của bào tử. Có thể dàn mỏng lát cắt bằng kim khêu nấm trước khi đậy lamen hoặc hơ lam kính lên đèn cồn để loại bỏ bóng khí trong tiêu bản.

2.3.2.2. Đối với mẫu đất

Mẫu đất được để khô tự nhiên. Hòa tan 100 g đất đã khô vào 900ml nước, ngâm trong 24 giờ để đất rã ra hoàn toàn. Đổ hỗn hợp thu được qua bộ sàng 6 rây (kích thước lỗ rây lần lượt là 500, 250, 125, 71, 40 và 25m). Các hỗn hợp thu được phía trên rây 40 và 25m được rửa trên giấy lọc. Sau khi rửa sạch và để khô, phần thu được trên giấy lọc sẽ được cho vào ống ly tâm 50ml. Thêm vào ống ly tâm 15ml dịch Chloroform hoặc CaCl₂ khuấy đều, ly tâm 3000 vòng/phút trong 15 phút. Thu phần dung dịch và lọc qua giấy lọc. Hòa phần thu được trên giấy lọc vào 1ml lactoglycerol.

Dùng ống hút lấy dung dịch thu được ở trên nhỏ lên lam và kiểm tra dưới kính hiển vi. Quan sát và đo đếm đặc điểm hình thái của bào tử dưới kính hiển vi so sánh với đặc điểm hình thái của bào tử đông của nấm Synchytrium endobioticum (phụ lục 1)

Sau khi khẳng định kết quả giám định là bệnh ung thư khoai tây (Synchytrium endobioticum (Schilb) Percival) thuộc danh mục dịch hại KDTV của Việt Nam, đơn vị giám định phải gửi báo cáo về Cục Bảo vệ thực vật kèm theo phiếu kết quả giám định (phụ lục 2).

Tất cả các đơn vị thuộc hệ thống Bảo vệ và KDTV phải lưu giữ, quản lý và khai thác dữ liệu về kết quả điều tra, báo cáo và giám định bệnh ung thư khoai tây (Synchytrium endobioticum (Schilb) Percival).

Đối với đơn vị lần đầu tiên giám định và phát hiện được bệnh ung thư khoai tây (Synchytrium endobioticum (Schilb) Percival) phải gửi mẫu hoặc tiêu bản về Trung tâm Giám định kiểm dịch thực vật để thẩm định và báo cáo Cục Bảo vệ thực vật trước khi công bố và xử lý dịch theo quy định của pháp luật hiện hành.

Đơn vị giám định phải lưu mẫu theo Quy chuẩn kỹ thuật hiện hành về thời gian để giải quyết khiếu nại về kết quả giám định (nếu có).

Cục Bảo vệ thực vật có trách nhiệm phổ biến; tổ chức, hướng dẫn và kiểm tra việc thực hiện Quy chuẩn này trong hệ thống tổ chức chuyên ngành Bảo vệ và Kiểm dịch thực vật cũng như các tổ chức, cá nhân khác có liên quan;

Các tổ chức, cá nhân có hoạt động liên quan đến điều tra, thu thập mẫu, xử lý và bảo quản mẫu bệnh ung thư khoai tây (Synchytrium endobioticum (Schilb) Percival) tại Việt Nam phải tuân theo quy định của quy chuẩn này cũng như các quy định của pháp luật có liên quan hiện hành.