Quy chuẩn Việt Nam QCVN 01-173:2014/BNNPTNT Ban hành ngày 05/06/2014

I. QUY ĐỊNH CHUNG

1.1. Phạm vi điều chỉnh

Quy chuẩn này quy định quy trình giám định bệnh khô cành cam quýt Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili - là dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm I của Việt Nam

1.2. Đối tượng áp dụng

Quy chuẩn này áp dụng đối với các tổ chức, cá nhân Việt Nam hoặc nước ngoài có hoạt động liên quan đến lĩnh vực bảo vệ và kiểm dịch thực vật thực hiện giám định bệnh khô cành cam quýt Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili - là dịch hại kiểm dịch thực vật (KDTV) nhóm I thuộc Danh mục dịch hại KDTV của Việt Nam.

1.3. Giải thích từ ngữ

Trong quy chuẩn này, các từ ngữ dưới đây được hiểu như sau:

1.3.1. Dịch hại kiểm dịch thực vật (plant quarantine pest)

Là loài dịch hại có nguy cơ gây hại nghiêm trọng tài nguyên thực vật trong một vùng mà ở đó loài sinh vật này chưa xuất hiện hoặc xuất hiện có phân bố hẹp và phải được kiểm soát chính thức.

1.3.2. Thực vật (plant)

Là cây và những bộ phận của cây còn sống, kể cả hạt giống và sinh chất có khả năng làm giống.

1.3.3. Mẫu (sample)

Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật hoặc tàn dư của sản phẩm thực vật được lấy ra theo một qui tắc nhất định.

1.3.4. Tiêu bản (specimen)

Là mẫu vật điển hình tiêu biểu của dịch hại được xử lý để dùng cho việc định loại, nghiên cứu, giảng dạy, phổ biến kỹ thuật và trưng bày thành các bộ sưu tập.

1.3.5. Phản ứng chuỗi trùng hợp hoặc phản ứng khuếch đại gen (Polymerase Chain Reaction - PCR)

Là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống

II. QUY ĐỊNH KỸ THUẬT

2.1. Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu

2.1.1. Thu thập mẫu

Đối với hàng xuất, nhập khẩu, quá cảnh hoặc vận chuyển, bảo quản trong nước: Tiến hành lấy mẫu theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4731:891 "Kiểm dịch thực vật - phương pháp lấy mẫu", quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-22:2010/BNNPTNT¹ "Phương pháp kiểm tra cây xuất nhập khẩu và quá cảnh".

Đối với cây trồng ngoài đồng ruộng: Lấy mẫu theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-38/2010/BNNPTNT¹ "Phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng".

2.1.2. Bảo quản mẫu

Các bộ phận tươi có triệu chứng bệnh (cành, lá, thân) chứa trong các túi ni-lông có lỗ thông khí bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 3 - 5^oC.

Các tiêu bản lam của nấm được dán nhãn, để trong hộp chuyên dụng đựng tiêu bản lam và bảo quản ở nhiệt độ phòng.

2.2. Thiết bị dụng cụ, hóa chất

Kính lúp soi nổi có độ phóng đại 10 - 40 lần, kính hiển vi có độ phóng đại 40 - 1.000 lần.

Máy ly tâm, máy lắc, tủ sấy, tủ định ôn, cân điện, máy trộn dịch, máy PCR, máy điện di, buồng tối và máy chụp ảnh

Bộ dao, kim giải phẫu, panh, kéo, bộ piptet, găng tay, đèn cồn, đĩa petri, ống hút, lam, lamen, bình tam giác, cốc đong, ống ly tâm 1,5ml.

Cồn 70^o, cồn tuyệt đối, parafin, lactophenol blue, acid acetic, nước cất vô trùng.

Nitơ lỏng, NaCI, phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1), chloroform, isopropanol, Proteinase K, Tris-HCI, EDTA, SDS.

MgCI₂ ,KCI, dNTP, mồi, Taq DNA polymerase, agarose.

2.3. Phương pháp phát hiện và giám định bệnh

2.3.1. Phát hiện và thu thập mẫu bệnh

Khi lá bị nhiễm bệnh gân lá trở nên trong (gân chính hoặc gân phụ), lá cong và biến vàng, chồi non cũng bị biến vàng. Sau đó lá rụng còn lại cuống lá, cành bị héo và bị chết ngọn (hình 1 đến hình 4, phụ lục 1). Đôi khi trên lá rụng các gân chính hoặc gân phụ có thể biến thành màu đỏ.

Cành bị bệnh có màu nâu hoặc màu nâu nhạt và bị nứt ra bệnh nặng đoạn thân và cành khô, có màu xám tro, trên mặt vết bệnh có các hạt nhỏ màu đen (hình 5, phụ lục 1)

Trên thân cây nhiễm bệnh, khi cắt ngang các mô cây hóa màu hồng hoặc nâu với các mô già (hình 6, phụ lục 1).

2.3.2. Phương pháp giám định bằng đặc điểm hình thái nấm gây bệnh

2.3.2.1. Phương pháp kiểm tra trực tiếp

Bào tử và các quả cành của nấm P. tracheiphila có thể quan sát trực tiếp dưới kính hiển vi quang học. Để quan sát rõ cấu trúc của bào tử và quả cành có thể nhuộm bằng lactophenol blue.

Dùng kim khêu nấm khêu bào tử nấm và quả cành trực tiếp từ các bộ phận bị phần nghi ngờ nhiễm bệnh hoặc có triệu chứng điển hình, đặt lên lam đã có 01 giọt lactophenol và đậy lamen. Đặt lam lên kính hiển vi và quan sát đặc điểm hình thái, đo kích thước bào tử nấm và so sánh với đặc điểm bào tử của nấm P. tracheiphila (phụ lục 1).

2.3.2.2. Phương pháp để ẩm

Các cành khô, các mẫu thân có triệu chứng bệnh (trên cành có các vùng khô màu xám chì hoặc xám tro, các thân cây mà mạch dẫn hóa màu hồng) để ẩm trong 12-24 giờ. Sau đó dùng kim khêu nấm khêu bào tử trực tiếp từ các phần nghi ngờ nhiễm bệnh, đặt lên lam đã có 01 giọt lactophenol. Đặt lam lên kính hiển vi và tìm, quan sát đặc điểm hình thái, đo kích thước bào tử nấm.

Quan sát trên kính hiển vi so sánh với đặc điểm bào tử của nấm P. tracheiphila (phụ lục 1)

2.3.2.3. Phương pháp phân lập nấm từ vật liệu nhiễm bệnh

Cắt ở phần rìa vết bệnh một đoạn thân, cành khoảng 20-100mm và nhúng vào cồn tuyệt đối. Sau đó, đốt đoạn thân trên đèn cồn. Khi lửa tắt dùng dao khử trùng cắt ngang hoặc dọc đoạn thân, cành thành những lát mỏng.

Nuôi cấy các lát mỏng trên môi trường PDA hoặc CPA ở 22-24^oC. Sau 3-5 ngày, kiểm tra sắc tố nấm tiết ra trên đĩa môi trường bằng cách soi đĩa lên ánh sáng (hình 9, phụ lục 1). Tiếp theo, cấy truyền làm thuần nấm.

Khêu mẫu nấm đã thuần từ môi trường nuôi cấy đưa lên lam và quan sát dưới kính hiển vi. Quan sát đặc điểm hình thái của bào tử nấm thu được.

So sánh với đặc điểm hình thái của bào tử nấm P. tracheiphila (phụ lục 1)

2.3.3. Phương pháp giám định PCR

Sử dụng phương pháp PCR để giám định nấm P. tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili gây bệnh khô cành cam quýt.

Quy trình chi tiết như phụ lục 2.

III. THẨM ĐỊNH KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH VÀ BÁO CÁO

Sau khi khẳng định kết quả giám định bệnh khô cành cam quýt Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili- là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam, đơn vị giám định phải gửi báo cáo về Cục Bảo vệ thực vật kèm theo phiếu kết quả giám định (phụ lục 4).

Tất cả các đơn vị thuộc hệ thống Bảo vệ và KDTV phải lưu giữ, quản lý và khai thác dữ liệu về kết quả điều tra, báo cáo và giám định bệnh khô cành cam quýt.

Đối với đơn vị lần đầu tiên giám định và phát hiện được bệnh khô cành cam quýt Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili phải gửi mẫu hoặc tiêu bản về Trung tâm Giám định kiểm dịch thực vật để thẩm định.

Đơn vị giám định phải đảm bảo thời gian lưu mẫu theo quy định hiện hành.

IV. TỔ CHỨC THỰC HIỆN

Cục Bảo vệ thực vật có trách nhiệm phổ biến; tổ chức, hướng dẫn và kiểm tra việc thực hiện Quy chuẩn này trong hệ thống tổ chức chuyên ngành Bảo vệ và Kiểm dịch thực vật cũng như các tổ chức, cá nhân khác có liên quan;

Các tổ chức, cá nhân có hoạt động liên quan đến điều tra, thu thập mẫu, xử lý và bảo quản mẫu bệnh khô cành cam quýt Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili tại Việt Nam phải tuân theo quy định của quy chuẩn này cũng như các quy định của pháp luật có liên quan hiện hành.