Quy chuẩn Việt Nam QCVN 01-34:2010/BNNPTNT

I . QUY ĐỊNH CHUNG

1.1. Phạm vi điều chỉnh

Quy chuẩn này quy định Quy trình giám định tuyến trùng Ditylenchus dipsaci (Kühn, 1857) Filipjev, 1936 và Ditylenchus destructor Thorne, 1945 là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam

1.2. Đối tượng áp dụng

Quy chuẩn này áp dụng đối với mọi tổ chức, cá nhân Việt Nam hoặc nước ngoài có hoạt động liên quan đến lĩnh vực bảo vệ và kiểm dịch thực vật tại Việt Nam (viết tắt là KDTV) thực hiện giám định tuyến trùng Ditylenchus dipsaci (Kühn, 1857) Filipjev, 1936 và Ditylenchus destructor Thorne, 1945 là dịch hại kiểm dịch thực vật (KDTV) thuộc Danh mục dịch hại KDTV của Việt Nam ban hành kèm theo Quyết định số 73/2005/QĐ-BNN ngày 14/11/2005 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và PTNT.

1.3. Giải thích từ ngữ

Trong quy chuẩn này, các từ ngữ dưới đây được hiểu như sau:

1.3.1. Dịch hại kiểm dịch thực vật: Là loài dịch hại có nguy cơ gây hại nghiêm trọng tài nguyên thực vật trong một vùng mà ở đó loài sinh vật này chưa xuất hiện hoặc xuất hiện có phân bố hẹp và phải được kiểm soát chính thức.

1.3.2. Thực vật: Là cây và những bộ phận của cây còn sống, kể cả hạt giống và sinh chất có khả năng làm giống.

1.3.3. Tuyến trùng ký sinh thực vật (phytonematoda): Là những loài tuyến trùng chủ yếu sống trong đất và có quan hệ chặt chẽ với thực vật đang phát triển. Chúng sống và ký sinh ở tất cả các phần của thực vật bao gồm rễ, củ, thân, lá và hoa của các thực vật đang phát triển.

1.3.4. Mẫu: Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật, tàn dư của sản phẩm thực vật hoặc đất được lấy ra theo một qui tắc nhất định.

1.3.5. Mẫu ban đầu: Là khối lượng mẫu thực vật, sản phẩm thực vật, tàn dư của sản phẩm thực vật hoặc đất được lấy ra từ một vị trí trong lô vật thể.

1.3.6. Mẫu chung: Là mẫu gộp các mẫu ban đầu.

1.3.7. Mẫu trung bình: Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật, tàn dư của sản phẩm thực vật hoặc đất được lấy từ mẫu chung theo một qui tắc nhất định, dùng làm mẫu lưu và mẫu phân tích.

1.3.8. Mẫu phân tích: Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật, tàn dư của sản phẩm thực vật hoặc đất được dùng để phân tích, giám định dịch hại trong phòng thí nghiệm.

1.3.9. Tiêu bản: Là mẫu vật điển hình tiêu biểu của dịch hại được xử lý để dùng cho việc định loại, nghiên cứu, giảng dạy, phổ biến kỹ thuật và trưng bày thành các bộ sưu tập.

2.1. Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu

- Đối với hàng hoá xuất, nhập khẩu, quá cảnh hoặc vận chuyển, bảo quản trong nước: Tiến hành lấy mẫu theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4731-89, qui chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-21:2010/BNNPTNT, QCVN 01-22: 2010/BNNPTNT, QCVN 01-23: 2010/BNNPTNT.

- Đối với cây trồng ngoài đồng ruộng: Lấy mẫu theo phương pháp của qui chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện sinh vật hại cây trồng.

Mẫu được lưu giữ và bảo quản như sau:

- Các bộ phận tươi có triệu chứng nghi là tuyến trùng (cành, lá, thân, củ, rễ...) được để trong các túi ni-lông có lỗ thông khí, có đính nhãn và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 5^oC.

- Các sản phẩm khô có triệu chứng nghi là tuyến trùng (hạt, quả khô,...) được để trong các túi ni-lông hoặc hộp nhựa kín có dán nhãn và bảo quản ở nhiệt độ phòng.

- Mẫu đất được cho vào túi ni-lông có lỗ thông khí, có đính nhãn và để ở những nơi thoáng mát hoặc ở nhiệt độ phòng.

- Dung dịch có tuyến trùng được tách ra từ bộ phận bị hại để trong các llọ kín có dán nhãn và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 – 10^oC.

- Tiêu bản lam phải có nhãn ký hiệu mẫu, để trong hộp chuyên dụng đựng tiêu bản lam và được bảo quản ở nhiệt độ phòng.

2.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất dùng làm tiêu bản và giám định

- Kính lúp soi nổi có độ phóng đại 10 – 40 lần (10x – 40x), kính hiển vi có độ phóng đại 40 – 1.000 lần (40x – 1000x).

- Chậu thuỷ tinh có dung tích 4 lít, cốc thuỷ tinh 100ml, chén thuỷ tinh 4ml, đũa thuỷ tinh, khay men, giấy lọc.

- Kim gắp tuyến trùng, đĩa đồng hồ, kim dầm mẫu, đĩa petri, lam, lamen.

- Rây lọc tuyến trùng có đường kính mắt rây là: 25mm, 75mm, 150mm, 250mm, 700mm, 1.000mm, lưới lọc có đường kính mắt lưới 2mm.

- Máy ly tâm, tủ định ôn, bình hút ẩm

- Dung dịch ZnSO₄ hoặc MgSO₄ hoặc đường sacazosa (tỷ trọng 1,18), formaldehyde (40%), glycerol (tinh khiết), triethanolamine (tinh khiết), nước cất.

2.3. Phương pháp tách lọc tuyến trùng

Các bộ phận của cây (rễ, thân, lá, củ, hạt...) được rửa sạch, chọn các bộ phận của cây có vết tổn thương, biến dạng, biến màu hoặc không bình thường đặt vào đĩa petri. Thêm nước vào đĩa để giữ cho mẫu không bị khô. Đặt đĩa petri có mẫu dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 10 đến 40 lần.

Dùng kim dầm nhẹ mẫu và quan sát tìm tuyến trùng. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim gắp tuyến trùng lên lam và quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại từ 40 – 1.000 lần.

Mẫu thực vật (thân, rễ, lá...) được rửa sạch, cắt thành những đoạn thật nhỏ (khoảng 0.5mm). Đặt mẫu đã cắt lên trên rây và thêm nước vừa xâm xấp rây. Sau 24 giờ, đổ nước dưới rây vào cốc thuỷ tinh. Dùng ống hút lấy dung dịch thu được ở cốc thuỷ tinh cho vào đĩa đồng hồ và kiểm tra dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 10 – 40 lần. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim gắp tuyến trùng lên lam và quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 40 – 1.000 lần. Kiểm tra lần lượt cho đến khi hết nước trong cốc thuỷ tinh.

2.3.1.3. Phương pháp ly tâm

Mẫu thực vật (thân, lá, rễ...) được rửa sạch, cắt thành từng đoạn 0,5cm, trộn đều và cân lấy 5-10 gram (tuỳ theo lượng mẫu có). Thêm 250ml nước sạch, nghiền nhỏ mẫu bằng máy xay sinh tố. Lọc qua rây có đường kính 1200mm, dùng vòi nước nhỏ rửa sạch từ phía trên xuống cho đến khi phần mẫu nghiền phía trên rây sạch. Thu phần nước phía dưới và thêm nước cho đủ 1 lít, khuấy đều.

Lấy 100ml dung dịch thu được ở trên cho vào ống nghiệm. Thêm 01 thìa (cà phê) bột cao lanh vào ống và khuấy đều bằng máy khuấy. Đặt ống nghiệm vào máy ly tâm và ly tâm với vận tốc 1.800 vòng/phút trong 4 phút. Sau đó, bỏ phần dung dịch phía trên, giữ lại phần cặn phía dưới. Thêm dung dịch ZnSO_{4 ­} hoặc MgSO₄ hoặc đường sacazosa (cao hơn 1cm so với bề mặt của lớp cặn) và khuấy đều trong 1 phút. Tiếp tục ly tâm với vận tốc 1.800 vòng/phút trong 4 phút.

Đổ phần dung dịch phía trên của ống ly tâm qua rây lọc có đường kinh 5mm vào cốc thuỷ tinh để kiểm tra. Dùng ống hút lấy dung dịch thu được ở cốc thuỷ tinh cho vào đĩa đồng hồ và kiểm tra dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 10 – 40 lần. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim gắp tuyến trùng lên lam và quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 40 – 1.000 lần. kiểm tra lần lượt cho đến khi hết nước trong cốc thuỷ tinh.

Rửa phần trên rây bằng nước sạch và dùng bình xịt nước để rửa, thu tuyến trùng bám dính trên rây vào cốc thuỷ tinh và tiến hành kiểm tra tuyến trùng tương tự như trên.

Cân 100 gram đất cho vào chậu thuỷ tinh, cho thêm 2 – 3 lít nước vào chậu thuỷ tinh và ngâm trong 1 – 2 giờ cho đất tan. Khuấy đều đất và nước, để lắng trong 10 giây. Sau đó lọc qua rây có đường kính 1.000mm, rửa sạch rây và phần cặn trên rây. Dung dịch được thu vào chậu thuỷ tinh thứ 2. Bỏ phần cặn còn lại trên rây và trong chậu thuỷ tinh ban đầu. Quá trình này lặp lại 2-3 lần nhằm loại bỏ cát, sạn, rác và đá.

Khuấy đều dung dịch đã thu được ở trên và tiếp tục lọc bằng rây có đường kính 700mm, dung dịch được thu vào chậu thuỷ tinh. Phần cặn trên rây được rửa sạch và cho vào cốc thuỷ tinh. Tiếp tục lọc dung dịch thu được ở chậu thuỷ tinh qua các rây có đường kính 250mm, 150mm và 25mm. Phần cặn trên rây cũng được rửa sạch và cho vào cốc thuỷ tinh. Riêng với rây 25mm có thể lọc lại 3 – 4 lần.

Nếu lượng nước thu được trong cốc thuỷ tinh quá đầy, để lắng trong 2 giờ và đổ bớt nước phía trên. Tiếp đó, chuyển dung dịch trên sang rây lọc tĩnh. Sau 24 – 48 giờ, đổ nước dưới rây vào cốc thuỷ tinh. Dùng ống hút lấy dung dịch thu được ở cốc thuỷ tinh cho vào đĩa đồng hồ và kiểm tra dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 10 – 40 lần. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim gắp tuyến trùng lên lam và quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 40 – 1.000 lần. Kiểm tra lần lượt cho đến khi hết nước trong cốc thuỷ tinh.

Chuẩn bị khay và lưới lọc có đường kính mắt lưới 2mm. Đặt lớp giấy lọc lên trên mặt lưới. Cân lượng đất cần kiểm tra (tối thiểu là 100gram) và rải đều trên mặt giấy. Thao tác đặt giấy và rải đất phải thật nhẹ để tránh rách, thủng giấy lọc. Đổ nước theo mép khay sao cho nước vừa ướt đất. Sau 24 – 48giờ, đổ nước dưới rây vào cốc thuỷ tinh và kiểm tra dần bằng đĩa đồng hồ dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 10 – 40 lần. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim gắp tuyến trùng lên lam và quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 40 – 1.000 lần. Kiểm tra lần lượt cho đến khi hết nước trong cốc thuỷ tinh.

Chú ý: Lưới lọc phải có chân hoặc quai (gác lên thành khay) để khi đặt trong khay, đáy của lưới lọc không chạm sát đáy khay.

Cân 100 gram đất vào cốc thuỷ tinh, thêm 250ml nước, khuấy đều. Lọc qua rây có đường kính 1.200mm, dùng vòi nước rửa kỹ phần trên rây, loại bỏ phần cặn còn lại trên rây. Thu phần nước dưới rây, thêm nước cho đủ 1 lít và khuấy đều.

Lấy 100 ml dung dịch thu được ở trên vào ống nghiệm. Thêm 01 thìa cà phê bột cao lanh vào ống và khuấy đều bằng máy khuấy. Đặt ống nghiệm vào máy và ly tâm với vận tốc 1.800 vòng/phút trong 4 phút.

Bỏ phần dung dịch phía trên, giữ lại phần cặn phía dưới. Thêm dung dịch ZnSO₄ hoặc MgSO₄ hoặc đường sacazosa (cao hơn 1cm so với bề mặt của lớp cặn). Khuấy đều trong 1 phút. Tiếp tục ly tâm với vận tốc 1.800 vòng/phút trong 4 phút.

Đổ dung dịch phía trên qua rây lọc có đường kính 5mm. Rửa phần trên rây bằng nước sạch và dùng bình xịt nước để rửa, thu tuyến trùng bám dính trên rây vào cốc.

Dùng ống hút lấy dung dịch thu được ở cốc thuỷ tinh cho vào đĩa đồng hồ và kiểm tra dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 10 – 40 lần. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim gắp tuyến trùng lên lam và quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 40 – 1.000 lần. Kiểm tra lần lượt cho đến khi hết nước trong cốc thuỷ tinh.

2.4. Phương pháp làm tiêu bản tuyến trùng

2.4.1. Dung dịch bảo quản tuyến trùng

Tuyến trùng ký sinh thực vật thu được từ một trong các phương pháp tách lọc nêu trên được đưa vào một trong ba loại dung dịch dưới đây để bảo quản tuyến trùng.

* Chú ý: để tiêu bản tuyến trùng giữ được hình dáng đặc trưng, trước khi cho vào dung dịch bảo quản nên xử lý nhiệt tuyến trùng bằng nước ở nhiệt độ 70–80^oC trong 5 phút.

- Dung dịch 1: Formalin

Dung dịch Formadehyde 4%.

- Dung dịch 2: Formalin - glycerol (FG)

Formalin (40%) Formaldehyde): 10ml

Glycerol: 01ml

Nước cất: 89ml

- Dung dịch 3: TAF

Triethanolamine: 02ml

Formalin (40% formaldehyde): 07ml

Nước cất: 91ml

2.4.2. Phương pháp xử lý và làm tiêu bản tuyến trùng

- Dung dịch xử lý:

Dung dịch 1: Cồn (96%) 25ml

Glycerol 01ml

Nước cất 79ml

Dung dịch 2: Cồn (96%) 95ml

Glycerol 05ml

- Cách tiến hành:

Gắp tuyến trùng từ dung dịch bảo quản vào chén thuỷ tinh có chứa 0,5ml dung dịch xử lý (dung dịch 1) . Đặt chén này trong bình hút ẩm đậy kín có chứa 1/10 thể tích cồn 96^o. Bình hút ẩm được đặt trong tủ ấm ở điều kiện nhiệt độ cố định 40^oC với thời gian tối thiểu là 12 giờ.

Lấy chén thuỷ tinh ra khỏi bình hút ẩm, thêm dung dịch 2. Đậy nắp một phần miệng chén để cồn bay hơi từ từ. Chén thuỷ tinh có chứa tuyến trùng tiếp tục giữ trong tủ ấm ở điều kiện nhiệt độ cố định 40^oC. Sau 2-3 giờ bổ sung thêm dung dịch 2 vào chén thuỷ tinh cho gần đầy, làm lại 2 – 3 lần. sau khi tuyến trùng chỉ còn lại trong Glycerol có thể sử dụng làm tiêu bản được.

Hoặc đặt chén thuỷ tinh chứa tuyến trùng trong glycerol nguyên chất trên trong bình hút ẩm có chứa vôi. Bảo quản lâu dài để làm tiêu bản cố định.

Lấy lam kính sạch và làm vòng parapin hoặc sáp ong (đường kính khoảng 1cm) trên lam kính. Cho 1 giọt glycerol nguyên chất vào giữa vòng parapin hoặc sáp ong. Dùng kim gắp, gắp 5 con tuyến trùng (đã xử lý trong dung dịch cố định) đặt vào giữa giọt glycerol, chỉnh cho các cá thể tuyến trùng nằm cùng một hướng. Đậy lamen và đặt lam kính trên bàn nhiệt cho parapin hoặc sáp ong tan chảy. Nhấc nhanh lam kính và đặt ra chỗ mát. Gắn keo bảo vệ.

2.5. Trình tự giám định

2.5.1. Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi có độ phóng đại từ 40 – 1.000 lần các chỉ tiêu sau

- Hình dạng kim hút, môi, đuôi, tuyến thực quản, đường bên của tuyến trùng, gai giao cấu của con đực, cơ quan sinh sản, tử cung sau của con cái.

- Hình dạng và đo kích thước của tuyến trùng cái và đực.

- Hình dạng và đo kích thước trứng.

III. THẨM ĐỊNH KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH VÀ BÁO CÁO

Sau khi khẳng định kết quả giám định tuyến trùng Ditylenchus dipsaci (Kuhn) Filipjev hoặc Ditylenchus destrutor Thorne là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam, đơn vị giám định phải gửi báo cáo về Cục Bảo vệ thực vật kèm theo phiếu kết quả giám định (xem phụ lục B).

Đối với đơn vị lần đầu tiên giám định và phát hiện được tuyến trùng Ditylenchus dipsaci (Kuhn) Filipjev hoặc Ditylenchus destrutor Thorne phải gửi mẫu hoặc tiêu bản về Trung tâm Giám định kiểm dịch thực vật để thẩm định.

Đơn vị giám định phải đảm bảo thời gian lưu mẫu theo quy định kỹ thuật hiện hành.
(Mời xem tiếp trong file tải về)